Note ABES In vivo and in vitro directed evolution of enzymes using droplet-based microfluidics Evolution dirigée d'enzymes in vivo et in vitro par microfluidique de gouttelettes Ingéniérie des protéines Evolution dirigée Microfluidique en gouttelettes Criblage à haut débit Rétro-aldolase Détergent protéases Enzymes Expression in vitro Protein engineering Directed evolution Droplet-based microfluidics High-throughput screening Retro-aldolase Detergent proteases Enzymes In vitro expression 547.7 660.29 Enzymes Microfluidique Criblage pharmacologique L’ingénierie des protéines fonctionnelles est un processus d’amélioration des propriétés physiques ou catalytiques d’enzyme au travers d’approches rationnelles et d'évolution dirigée, aussi bien que la combinaison des deux méthodes. Malgré le progrès de la modélisation moléculaire des protéines, les méthodes de prédiction restent aléatoires et un grand nombre de variantes restent à tester. De ce fait, le développement et l’utilisation d’un système de criblage d’activité de protéines à très haut débit, comme la microfluidique en gouttes, est indispensable. Cette thèse de doctorat présente trois projets d’évolution dirigée de protéines en trois approches différentes avec expression d’enzyme in vitro et in vivo. Les plateformes microfluidiques ont été développées et validées pour chaque projet. De plus, plusieurs banques de variants ont été criblées avec, dans certains cas, isolement de molécules 5-10 fois que le clone parental. This work describes the development of high-throughput droplet microfluidic platforms fine-tuned for protein of interest and their employment in directed evolution experiments. When not available, fluorogenic assay for monitoring desired enzyme activity (-ies) in droplets was developed. Moreover, the in vivo expression allowed the successive integration of microfluidic modules on the same chip. After a couple of evolution rounds the initial retro-aldolase variant was significantly improved. In other project, to meet industrial requirements a high-throughput screening platform for protease evolution in detergent has been assembled and validated. Two evolution rounds showed the accumulation of a certain pool of beneficial mutations over the selection rounds. The research described in this work highlighted that in vitro expression systems are sensitive to the amount of supplied DNA and reaction conditions. This observation led to the development of a multistep completely in vitro microfluidic platform. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 12079997 Université de Strasbourg Strasbourg 2015-12-31 https://theses.hal.science/tel-01124086 application/pdf 8758439 https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2013/Godina_Alexei_2013_ED222.pdf http://www.theses.fr/2013STRAF061/abes https://theses.hal.science/tel-01124086 https://theses.hal.science/tel-01124086 https://theses.hal.science/tel-01124086 Godina Alexei 1986-04-27 MD 177610689 20917255 https://theses.fr/2013STRAF061 2013STRAF061 https://doi.org/10.70675/49f21636z0c89z4cf9za5bbz6ceab7155a46 2013-02-01 Chimie Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Griffiths Andrew D. MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 142400785 Winssinger Nicolas MADS_PRESIDENT_DU_JURY 115899383 Tabeling Patrick MADS_RAPPORTEUR_1 032952988 Bornscheuer Uwe Theo MADS_RAPPORTEUR_2 074656872 École doctorale des Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 CH 156504081 Institut de science et d’ingénierie supramoléculaires (Strasbourg) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 207480 157760227 ddc:540 ddc:660 Griffiths Andrew D. Winssinger Nicolas Tabeling Patrick Bornscheuer Uwe Theo École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....) Institut de science et d’ingénierie supramoléculaires (Strasbourg) PDF 12079997 confidentialité 2013-02-01 2015-02-02 confidentialité 2013-02-01 2015-02-02 confidentialité 2013-02-01 2015-02-02 confidentialité 2013-02-01 2015-02-02