Note ABES Immunité innée et contre-mesures virales : études structurales et biophysiques du complexe formé entre la cytidine désaminase humaine APOBEC3G et le facteur d'infectivité virale du VIH-1 Innate immunity and viral countermeasures : structural and biophysical studies of the complex formed between the human cytidine deaminase APOBEC3G/F and the HIV-1 viral infectivity factor Vif VIH-1 Immunité innée Facteurs de restriction virale Vif APOBEC Structure Cristallographie HIV-1 Innate immunity Viral restriction factors Vif APOBEC Structure Crystallization 572.8 571.96 616.97 Infections à VIH Génétique Antiprotéases du VIH Réplication de l'ARN Résistance aux maladies Cristallographie VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1) Dissertations universitaires Gènes vif Dissertations universitaires La protéine Vif (Viral infectivity factor) joue un rôle essentiel dans la réplication virale et dans le pouvoir infectieux du VIH-1. Elle est aussi qualifiée de « protéine de contre-défense » car elle neutralise un facteur cellulaire à action antivirale, APOBEC3 en recrutant le complexe de la E3 ubiquitine ligase formé de CBFβ/EloB/EloC/Cul5/Rbx2, qui va entrainer sa polyubiquitinilation et sa dégradation. APOBEC3 comprend une famille de protéines présentes dans les mammifères et capable d'induire des mutations dans l'ADN viral.La structure tridimensionnelle des molécules et complexes macromoléculaires étant intimement liée à la fonction, il est primordial de connaître la place d’A3G/F dans le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC ainsi que les détails des interactions entre Vif et A3G/F, ceci dans une perspective thérapeutique.La co-expression des différentes protéines de ce complexe a été réalisée dans deux systèmes d’expression : bactérien (E. coli) et eucaryote (BHK21) dû au manque de solubilité d’APOBEC et de la difficulté de sa cristallisation. Une fois les protéines exprimées et le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F formé dans les deux systèmes, des tests de cristallisation et des études structurales seront réalisés pour caractériser la structure et la fonction des protéines.Dans E. coli, j’ai réussi à obtenir le complexe Vif/CBFβ/EloB/EloC/Cul5 in vivo et in vitro de manière soluble, pure, monodisperse ainsi qu’en quantité adéquate avec les études biophysiques envisagées. Par contre, je n’ai pas réussi à surexprimer A3G. En passant dans les cellules de hamster BHK21 et en appliquant la technique du virus de la vaccine, nous avons réussi à obtenir le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F mais en quantité insuffisante pour la cristallisation.Les perspectives de ce projet seront d’améliorer : (1) les rendements du complexe pour des tests de cristallisation et (2) la pureté du complexe pour réaliser la cryo-microscopie électronique. APOBEC3 are human antiviral cytidine deaminase and RNA/DNA-editing enzymes that belong to the innate immune defense system, targeting retroviruses or retrotransposons. Among all APOBEC3 proteins, hA3B, hA3C, hA3DE, hA3F and hA3G are able to interfere negatively with HIV-1 infectivity: they induce a deamination of dC to dU in the minus strand DNA, resulting in G to A hypermutation in the plus strand DNA. This hypermutation results either into a degradation of U-rich DNA strands by the uracyl-DNA glycosylase or into the production of aberrant viral protein. In addition, a deaminase-independent mechanism is able to inhibit the HIV-1 reverse transcription through a yet unknown mechanism.To evade the host defense system, HIV expresses the virion infectivity factor, Vif, which causes the degradation of APOBEC3G by the proteasome by recruiting the E3 ubiquitin ligase complex composed of the CBFβ, EloB, EloC, Cullin5, Rbx2 proteins. The goal of this study will be the determination of the X-ray structure of the Vif/APOBEC-3 complex. Understanding this molecular recognition might be useful to direct structure-based design of anti-HIV drugs that act by inhibiting the action of Vif and lead to new anti-HIV drugs.To overcome the solubility problems of Vif and APOBEC3G/F, a co-expression strategy had been applied with the different E3 ubiquitin ligase proteins both in prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (BHK21) systems. Once the complex obtained, we will perform several structural and biophysical studies as well as crystallization trials.In E. coli, I managed to obtain the Vif/CBFβ/EloB/EloC/Cul5 complex in vivo and in vitro, soluble, monodisperse and in good quantities for structural studies. The protein A3G was not obtained in E. coli even by co-expression with the complex.On the other side, I succeeded in obtaining the polyprotein Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F complex in the hamster cells (BHK21) by applying the vaccinia virus strategy. Optimizing the yield and the purity is necessary for crystallization and more structural studies. Electronic Thesis or Dissertation Text fr PDF 16084543 Université de Strasbourg Strasbourg 2016-12-31 https://theses.hal.science/tel-01374420 application/pdf 15413124 https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2015/Mezher_Joelle_2015_ED414.pdf http://www.theses.fr/2015STRAJ053/abes https://theses.hal.science/tel-01374420 https://theses.hal.science/tel-01374420 https://theses.hal.science/tel-01374420 https://theses.hal.science/tel-01374420 https://theses.hal.science/tel-01374420 Mezher Joelle 1988-08-11 LB 195448812 21009845 https://theses.fr/2015STRAJ053 2015STRAJ053 https://doi.org/10.70675/76cd0aaaz2d0fz4281zaf99z5031ff50e07f 2015-09-29 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Ennifar Éric MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 060834978 Ruff Marc MADS_PRESIDENT_DU_JURY 167631543 Ruff Marc MADS_MEMBRE_DU_JURY_1 167631543 Tisné Carine MADS_RAPPORTEUR_1 131351834 Fribourg Sébastien MADS_RAPPORTEUR_2 092634427 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 VS 156502844 Architecture et réactivité de l'ARN (Strasbourg ; 1992-....) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 157545687 93780 ddc:570 ddc:610 Ennifar Eric Ruff Marc Ruff Marc Tisné Carine Fribourg Sébastien École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg) Architecture et réactivité de l'ARN (Strasbourg) PDF 16084543