Characterization of therapeutic proteins by capillary electrophoresis (CE) coupled to mass spectrometry (MS)
Caractérisation de protéines thérapeutiques par électrophorèse capillaire (CE) couplée à la spectrométrie de masse (MS)
Electrophorèse capillaire
Spectrométrie de masse
Anticorps monoclonaux
Glycosylations
Modification post-traductionnelles
Anticorps monoclonaux conjugués à un principe actif
Capillary electrophoresis
Mass spectrometry
Monoclonal antibodies
Glycosylation
Post-translational modifications
Antibodies drug conjugates
543
Anticorps monoclonaux
Glycosylation
Électrophorèse capillaire
Spectrométrie de masse
Chimie analytique
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif.
Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.
Electronic Thesis or Dissertation
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en
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7115791
Université de Strasbourg
Strasbourg
2018-12-31
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https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2017/SAID_Nassur_2017_ED222.pdf
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Said
Nassur
1989-09-08
FR
223946702
21215876
http://www.theses.fr/2017STRAF048
2017STRAF048
2017-09-18
Chimie analytique
Strasbourg
131056549
Doctorat
Docteur es
non
oui
Leize-Wagner
Emmanuelle
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181096676
Millet
Maurice
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François
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École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....)
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CH
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Chimie de la matière complexe (Strasbourg)
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Leize-Wagner
Emmanuelle
Millet
Maurice
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Yannis
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Rabah
Aubriet
Frédéric
Nehme
Reine
École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg)
Chimie de la matière complexe (Strasbourg)
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