Note ABES Imagerie de fluorescence à haute résolution : étude de la localisation nucléolaire de la protéine de la nucléocapside du VIH Nucleolar distribution of the HIV-1 nucleocapsid protein investigated by the super-resolution microscopy VIH-1 Protéine de la nucléocapside Nucléole Microscopie de fluorescence Microscopie à haute résolution DSTORM PALM Suivi de particules uniques Imagerie en deux couleurs HIV-1 Nucleocapsid protein Nucleolus Fluorescence microscopy Super-resolution microscopy DSTORM PALM Single particle tracking Two-color imaging 572.8 616.979 VIH (virus) Cytogénétique Infections à VIH Protéines virales Nucléoprotéines Microscopie de fluorescence Au cours de ce travail de thèse expérimental, nous nous sommes intéressés à l’étude de la localisation nucléaire et nucléolaire de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Des études antérieures menées au laboratoire avaient mis en évidence une très forte accumulation de la NC dans les nucléoles. Ce compartiment nucléaire est connu pour être ciblé par de nombreux virus afin de promouvoir leur réplication. Des expériences de microscopie électronique avaient révélé la structure complexe du nucléole et montré qu’il est composé de trois sous-compartiments : les centres fibrillaires, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire dans lesquels se déroule la synthèse des ribosomes. Afin de caractériser la localisation de la NC dans ces trois sous-compartiments, nous avons développé une approche de microscopie optique à haute résolution permettant d’obtenir des images à deux couleurs avec une résolution spatiale améliorée. Pour cela, nous avons mis au point un protocole qui permet d’utiliser simultanément une protéine fluorescente photocommutable et un fluorophore organique introduit par immunomarquage. Après avoir minimisé les aberrations optiques et corrigé les dérives mécaniques inhérentes au montage, nous avons visualisé simultanément la localisation de la NC surexprimée dans des cellules HeLa avec des marqueurs spécifiques des trois sous-compartiments nucléolaires (immunomarquage). La microscopie de fluorescence à haute résolution a permis de résoudre pour la première fois les différents compartiments et de montrer que la NC se localise préférentiellement dans le compartiment granulaire. Finalement, des expériences préliminaires avec des cellules vivantes ont permis de mettre en évidence que la NC est transportée de manière active dans le noyau et qu’elle pourrait interagir directement avec des protéines nucléolaires During this experimental thesis work, we investigated the nuclear and nucleolar localization of the nucleocapsid protein (NC) of HIV-1. Previous studies performed in our laboratory evidenced a strong accumulation of NC in a subnuclear structure called nucleolus. Playing role in multiple cellular processes, nucleolus is often targeted by viruses to promote their replication. Electron microscopy revealed three nucleolar components (fibrillar centers, dense fibrillar component and granular component) associated to specific steps of the ribosome biogenesis. To characterize the distribution of the NC in these three sub-compartments and therefore shed light on the nucleolar localization of NC during the replication cycle, we developed a high-resolution optical microscopy approach. After having minimized the optical aberrations and corrected the mechanical drifts inherent to the imaging setup, the NC-mEos2 fusion protein overexpressed in HeLa cells was visualized simultaneously with immunolabeled nucleolar markers. The use of high-resolution fluorescence microscopy enabled us to resolve for the first time the three nucleolar compartments and to demonstrate the preferential localization of NC in the granular compartment of nucleolus. Finally, preliminary experiments performed with living cells showed that NC is actively transported in the nucleus and therefore may interact directly with nucleolar proteins. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 10906184 Université de Strasbourg Strasbourg 2019-12-31 https://theses.hal.science/tel-02111092 application/pdf 9399131 https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2018/glushonkov_Oleksandr_2018_ED414.pdf http://www.theses.fr/2018STRAJ028/abes https://theses.hal.science/tel-02111092 https://theses.hal.science/tel-02111092 https://theses.hal.science/tel-02111092 https://theses.hal.science/tel-02111092 Glushonkov Oleksandr 1991-06-18 FR 235456160 https://theses.fr/2018STRAJ028 2018STRAJ028 https://doi.org/10.70675/5151759cz8fd1z4b0bz9f09z0f350b30ecf2 2018-04-06 Biophysique Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Didier Pascal MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 101829728 Weiss Etienne MADS_PRESIDENT_DU_JURY 033355177 Sliwa Michel MADS_RAPPORTEUR_1 08084166X Favard Cyril MADS_RAPPORTEUR_2 172175151 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 156502844 Laboratoire de bioimagerie et pathologies (Strasbourg ; 2018-....) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 230334857 543258 ddc:570 ddc:610 Didier Pascal Weiss Etienne Sliwa Michel Favard Cyril École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Laboratoire de bioimagerie et pathologies (Strasbourg) PDF 10906184