Note ABES Caractérisation des fonctions des modifications post-traductionnelles de PCNA à l'aide d'un nouvel outil génétique Characterization of PCNA’s post-translational modification functions using a new genetic tool PCNA Modifications post-traductionnelles Nouvel outil génétique CRISPR-Cas9 Plasmide de complémentation Mutants PCNA D122A et E124A Voie de dégradation ubiquitine-dépendante CRL4Cdt2 P21 Re-réplication Mort cellulaire PCNA Post-translational modifications New genetic tool CRISPR-Cas9 Complementation plasmid Mutants PCNA D122A and E124A Ubiquitin-dependent protein degradation CRL4Cdt2 P21 Re-replication Cell death 572.8 Génétique moléculaire Protéines -- Modifications posttraductionnelles Cellules immunocompétentes Ubiquitine Antigène nucléaire de prolifération cellulaire PCNA est une protéine essentielle qui intervient dans de nombreux mécanismes cellulaires et qui possède de nombreuses modifications post-traductionnelles (MPTs) dont les fonctions de certaines, restent encore inconnues. Afin d’étudier la fonction de ces MPTs, nous avons développé un nouvel outil génétique permettant in cellulo, de substituer la protéine endogène PCNA par une version mutée de la protéine appelée version de complémentation. La technique consiste à cotransfecter des cellules en culture avec deux types de plasmides. Un premier plasmide permet l’invalidation du gène de PCNA endogène dans les cellules transfectées par le système CRISPR-Cas9. Le deuxième plasmide dit de complémentation permet l’expression d’une forme mutée de PCNA. Sur l’ensemble d’une banque de mutants testés, deux mutants de PCNA se sont avérés être létaux (D122A et E124A). Nous avons démontré que ces deux sites sont impliqués dans l’initiation d’une voie de dégradation ubiquitine dépendante CRL4Cdt2 essentielle pour la mise en place de la protéolyse d’un cocktail de protéines (cdt1, p21, set8) durant la phase S. Nous avons démontré que les cellules mutantes pour PCNA (D122A et E124A) accumulent la protéine p21. Ce défaut de dégradation de p21 provoque alors des évènements de re-réplication menant à terme à la mort des cellules mutantes. PCNA is an essential protein that is involved in many cellular mechanisms and has many post-translational modifications (PTMs). The functions of some PTMs, still remain unknown. In order to study the function of these PTMs, we have developed a new genetic tool allowing, in cellulo, the substitution of endogenous PCNA protein with a mutated version of the protein named complementation version. The technique involves cotransfection of the cells in culture with two types of plasmids. A first plasmid allows invalidation of the endogenous PCNA gene in transfected cells by the CRISPR-Cas9 system. The second plasmid, named complementation plasmid allows the expression of a mutated form of PCNA. In the whole bank of tested mutants, two PCNA mutants were found to be lethal (D122A and E124A). We have demonstrated that these two sites are involved in the initiation of an ubiquitin-dependent protein degradation CRL4Cdt2 pathway essential for the proteolysis of a protein cocktail (cdt1, p21, set8) during the S phase. We demonstrated that PCNA mutant cells (D122A and E124A) accumulate p21 protein. This lack of degradation of p21 then causes re-replication events leading ultimately to the mutant cells death. Electronic Thesis or Dissertation Text fr PDF 10867466 Université de Strasbourg Strasbourg 2019-12-31 https://theses.hal.science/tel-02333454 application/pdf 10804625 https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2019/Dietsch_frank_2019_ED414.pdf http://www.theses.fr/2019STRAJ014/abes https://theses.hal.science/tel-02333454 https://theses.hal.science/tel-02333454 https://theses.hal.science/tel-02333454 https://theses.hal.science/tel-02333454 https://theses.hal.science/tel-02333454 Dietsch Frank 1992-06-06 FR 24045362X https://theses.fr/2019STRAJ014 2019STRAJ014 https://doi.org/10.70675/5bea65e7z700dz4b97z8171z46f8b00d748f 2019-04-09 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Chatton Bruno MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 09839066X Dantzer Françoise MADS_PRESIDENT_DU_JURY 139532145 Chatton Bruno MADS_MEMBRE_DU_JURY_1 09839066X Dantzer Françoise MADS_MEMBRE_DU_JURY_2 139532145 Kannouche Patricia Laila MADS_MEMBRE_DU_JURY_3 130280747 Guittaut Michaël MADS_MEMBRE_DU_JURY_4 069517584 Kannouche Patricia Laila MADS_RAPPORTEUR_1 130280747 Guittaut Michaël MADS_RAPPORTEUR_2 069517584 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 156502844 Biotechnologie et signalisation cellulaire (Strasbourg ; 2011-....) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 157715205 207563 ddc:570 Chatton Bruno Dantzer Françoise Chatton Bruno Dantzer Françoise Kannouche Patricia Laila Boyer-Guittaut Michaël Kannouche Patricia Laila Boyer-Guittaut Michaël École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Biotechnologie et signalisation cellulaire (Strasbourg) PDF 10867466