Note ABES A new pathway for bacterial growth with chloromethane Une nouvelle voie pour la croissance bactérienne avec le chlorométhane Chlorométhane Déshalogénase Leisingera methylohalidivorans MB2 Méthylotrophie Chloromethane Dehalogenase Leisingera methylohalidivorans MB2 Methylotrophy 579.3 Chlorométhane Biodégradation Bacteries -- Croissance Génétique bactérienne Le chlorométhane (CH3Cl), un produit d'origine essentiellement naturelle, est responsable pour une part importante de la destruction de l'ozone stratosphérique. Certains micro-organismes sont capables de dégrader le CH3Cl, et impactent de manière significative la concentration de ce composé dans l'atmosphère. Jusqu'à présent, la seule voie de biodégradation du CH3Cl connue est la voie caractérisée en détail pour Methylobacterium extorquens CM4 (voie cmu). D'autres travaux de l'équipe ont montré que la souche marine Leisingera methylohalidivorans MB2, une autre Alphaproteobactérie dont la séquence génomique est connue, utilise le CH3Cl par une voie encore inconnue mais distincte de la voie cmu. Le but de mon projet de doctorat était d'étudier l'utilisation du CH3Cl chez L. methylohalidivorans MB2 par différentes approches expérimentales complémentaires.Dans ce travail, l'analyse des isotopes stables (CSIA) du CH3Cl basée sur les trois éléments chlore, carbone et hydrogène a confirmé que L. methylohalidivorans MB2 utilise effectivement un autre mécanisme que les bactéries possédant la voie cmu pour rompre les liaisons C-Cl et C-H du CH3Cl. La gamme très étroite de composés chimiques que la souche MB2 peut utiliser comme sources de carbone et d'énergie pour sa croissance a également été confirmée, et étendue à la choline (2-hydroxyéthyl-triméthylazanium). Ce composé aux propriétés osmoprotectrices, omniprésent dans le milieu marin, est connu comme substrat de croissance méthylotrophe. La choline a été utilisée comme substrat de croissance de référence pour des expériences de génétique et de protéomique visant à découvrir la CH3Cl déshalogénase de la souche MB2. La mutagenèse par mini-transposon a ainsi été développée comme premier outil génétique pour Leisingera. Deux loci clés (LEIME_2500 et LEIME_0707) essentiels pour l'utilisation du CH3Cl par la souche MB2 ont été identifiés. L'éthylmalonyl-CoA mutase LEIME_0707 est une enzyme-clé du métabolisme méthylotrophe par la voie de l'éthylmalonyl-CoA. LEIME_2500, codant une enzyme associée au méthylène-tétrahydrofolate de fonction inconnue, s'est avéré nécessaire pour la déshalogénation de CH3Cl, et pourrait donc contribuer à l'activité CH3Cl déshalogénase . La protéomique quantitative a été utilisée en parallèle pour identifier les protéines associées à la dégradation du CH3Cl. La protéine LEIME_2500 est la plus abondante parmi celles détectées lors de la croissance avec le CH3Cl seulement. La liste des protéines les plus abondantes dans la croissance avec le CH3Cl par rapport à la choline nous a permis de proposer un premier modèle d'utilisation du carbone par la souche MB2. Notamment et contrairement à ce qui avait été observé précédemment pour la souche CM4, il a été observé que l'utilisation du CH3Cl étaient retardée si la choline était également fournie comme substrat de croissance. Cette constatation, ainsi que des expériences préliminaires montrant que certains composés qui ne sont pas des substrats de croissance favorisent la croissance avec le CH3Cl, suggèrent d'autres différences importantes dans l'utilisation du CH3Cl entre la souche MB2 et les bactéries possédant la voie cmu. Ces travaux ouvrent de nouvelles pistes de recherche pour mieux définir et caractériser le métabolisme du CH3Cl dans la souche MB2. Les résultats obtenus ouvrent la voie à la caractérisation d'une déshalogénase d'un nouveau type, et contribueront à une meilleure compréhension du cycle biogéochimique global du CH3Cl, et de son importance sur notre planète. Chloromethane (CH3Cl) is mainly produced naturally, and responsible for a significant part of stratospheric ozone destruction. Some microorganisms are capable of degrading CH3Cl, and significantly contribute in defining the concentration of this compound in the atmosphere. Until now, the only known pathway for biodegradation of CH3Cl is the cmu (chloromethane utilisation) pathway, which was characterised in detail for Methylobacterium extorquens CM4. Other work by the team showed that another Alphaproteobacterium, the marine strain Leisingera methylohalidivorans MB2 of known genome sequence, grows with CH3Cl by an unknown route distinct from the cmu pathway. The goal of my PhD project was to investigate CH3Cl utilisation by L. methylohalidivorans strain MB2 using different complementary experimental approaches. In this work, triple-element compound-specific stable isotope analysis (CSIA) on chlorine, carbon and hydrogen first confirmed that L. methylohalidivorans MB2 indeed cleaves C-Cl and C-H bonds in CH3Cl by a different mechanism than cmu pathway bacteria. The very narrow range of chemically defined compounds that can be used by strain MB2 as sole carbon and energy source for growth was also confirmed, yet extended to the quaternary amine choline (2-hydroxy-N,N,N-trimethylethan-1-aminium), a chemical with osmoprotectant properties that is ubiquitous in the marine environment and a known methylotrophic growth substrate. Choline was used as a reference growth substrate in genetic and proteomic work designed to discover the elusive CH3Cl dehalogenase of strain MB2. Mini-transposon mutagenesis of strain MB2 was developed as a first genetic tool for Leisingera. Two key loci (LEIME_2500 and LEIME_0707) essential for CH3Cl utilization by strain MB2 were identified. Ethylmalonyl-CoA mutase LEIME_0707 is a key enzyme of methylotrophic metabolism by the ethylmalonyl-CoA pathway. The LEIME_2500 locus, coding a putative methylene tetrahydrofolate associated enzyme of unknown function, was shown to be required for dehalogenation of CH3Cl, and may thus contribute to CH3Cl dehalogenase activity. Label-free quantitative proteomics were used in parallel to identify proteins associated with CH3Cl degradation, with LEIME_2500 the most highly abundant protein uniquely found in the CH3Cl condition. The list of proteins with higher abundance with CH3Cl compared to choline allowed us to propose a first tentative model of carbon utilisation by strain MB2. Notably and unlike what was observed previously for the cmu pathway strain CM4, the onset and efficiency of CH3Cl utilisation was delayed if choline was also provided as growth substrate. This finding, together with preliminary experiments showing that compounds that are not growth substrates enhance growth with CH3Cl, suggest clear differences in CH3Cl metabolism between strain MB2 and cmu pathway bacteria. This work opens up new avenues of research to further define and characterize CH3Cl utilisation and metabolism in strain MB2. The obtained results pave the way for the detailed characterisation of a new type of dehalogenase enzyme, and will also contribute to a better understanding of the global biogeochemical cycle of CH3Cl, and its importance on our planet. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 40893204 Université de Strasbourg Strasbourg 2022-12-31 application/pdf 15671741 http://www.theses.fr/2021STRAJ003/document http://www.theses.fr/2021STRAJ003/abes Luo Jing 1989-01-20 FR 261222961 0EFB1S075V7 21724200 4200047 https://theses.fr/2021STRAJ003 2021STRAJ003 https://doi.org/10.70675/3c690706z5e70z4fc9z9676z5af24dab02c2 2021-03-12 Toxicologie et biologie de l’environnement Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Vuilleumier Stéphane MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 127892184 Gaquerel Emmanuel MADS_PRESIDENT_DU_JURY 102542023 Médigue Claudine MADS_RAPPORTEUR_1 08942719X Petit-Biderre Corinne MADS_RAPPORTEUR_2 161971385 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 414 156502844 Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 156733447 93783 ddc:570 Vuilleumier Stéphane Gaquerel Emmanuel Médigue Claudine Petit-Biderre Corinne École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) PDF 40893204 confidentialité 2021-03-12 2027-03-12 confidentialité 2021-03-12 2027-03-12 confidentialité 2021-03-12 2027-03-12 confidentialité 2021-03-12 2027-03-12