Note ABES Site-selective faithful monitoring at the single molecule level of local changes in nucleic acids Suivi site-sélectif et fidèle de modifications locales d'acides nucléiques en molécules uniques ThG Epigénétique Basculement de base UHRF1 DNMT1 Microscopie Molécule Unique Sra ThG Epigenetic UHRF1 DNMT1 SRA Miccroscopy Single molecule Base flipping 571.4 Épigénétique Parmi les acteurs de la régulation épigénétique qui régissent l'expression des gènes, la protéine UHRF1 joue un rôle clé dans le maintien et la transmission des modifications épigénétiques. Cette protéine recrute l'ADN méthyltransférase DNMT1 sur les sites CpG hémi-méthylés via son domaine SRA. Des études de cristallographie ont mis en lumière le mécanisme du complexe SRA/ADN et ont révélé que la protéine induit un basculement de base de la méthylcytosine. Au cours de ce travail de thèse, nous avons cherché à mieux comprendre la dynamique du processus de basculement des bases méthylcytosine au niveau de la molécule unique et à suivre le mécanisme d'interaction entre le domaine SRA et l'ADN hémiméthylé. Pour atteindre ces objectifs, deux méthodes différentes reposant sur la microscopie à molécule unique ont été développées. La première est basée sur le suivi de la dynamique au niveau de la molécule unique de la liaison de SRA à l'ADN hémi et non méthylé en surveillant l'intensité de FRET. La seconde approche visait à capturer le signal de la thiénoguanosine, thG, un analogue de la guanosine qui absorbe dans l'UV, à l'échelle de la molécule unique sur un microscope en champ large de notre conception, développé pendant la thèse. Des études antérieures réalisées dans notre laboratoire ont déjà montré l'efficacité de la thG dans le suivi en temps réel de la dynamique de basculement des bases induite par le domaine SRA de l'UHRF1 sur des duplex hémi-méthylés. Notre approche repose sur des expériences de molécules uniques avec de l'ADN marqué au thG, et soutenue par une nouvelle stratégie de résonance plasmonique pour augmenter sa luminosité. Among the actors of the epigenetic regulation that govern gene expression, the UHRF1 protein plays a key role in the maintenance and transmission of epigenetic modifications. During the replication process, this protein recruits the DNA methyltransferase DNMT1 to hemi-methylated CpG sites via its SRA domain. Crystallography studies have shed light on the mechanism behind the SRA/DNA complex and revealed that the protein induces a base-flipping of the methylcytosine. During this thesis work, we aimed at further understanding the dynamics of the methylcytosine base-flipping process at single molecule level and monitoring the interaction mechanism between the SRA domain and hemi-methylated DNA. To achieve these goals, two different methods relying on single molecule microscopy were developed. The first one is based on following the dynamics at a single molecule level of SRA binding to hemi and non-methylated DNA by monitoring the FRET intensity. The second approach was aimed at recording the signal of thienoguanosine, thG, an analogue of guanosine that absorbs in the UV, at a single molecule level on a home-made widefield setup developed during the thesis. Previous studies performed in our laboratory already showed the efficiency of thG in the real-time monitoring of base flipping dynamics induced by the SRA domain of UHRF1 on hemi-methylated duplexes. Our single molecule experiments with thG-labelled DNA are supported by a new strategy of plasmonic enhancement to increase its brightness. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 5095253 application/pdf 5146577 http://www.theses.fr/2022STRAJ128/document http://www.theses.fr/2022STRAJ128/abes Cathagne Raphaël 1991-03-11 FR 29218512X 2302005035L 21726270 4200047 https://theses.fr/2022STRAJ128 2022STRAJ128 https://doi.org/10.70675/e52c6e6fz319ez4b2czbc7fz96da543fb3e7 2022-07-25 Biophysique Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Mély Yves MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 031370128 Didier Pascal MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_2 101829728 Léonard Jérémie MADS_PRESIDENT_DU_JURY 089269233 Salomé Laurence MADS_RAPPORTEUR_1 033216711 Sliwa Michel MADS_RAPPORTEUR_2 08084166X École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 414 156502844 Laboratoire de bioimagerie et pathologies (Strasbourg ; 2018-....) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 543258 230334857 ddc:570 Mély Yves Didier Pascal Léonard Jérémie Salomé Laurence Sliwa Michel École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Laboratoire de bioimagerie et pathologies (Strasbourg ; 2018-....) PDF 5095253 confidentialité 2022-07-25 2027-07-25 confidentialité 2022-07-25 2027-07-25 confidentialité 2022-07-25 2027-07-25 confidentialité 2022-07-25 2027-07-25