Note ABES Development of a CRISPR-Cas12a system targeting human mitochondrial DNA Mise au point d'un système CRISPR-Cas12a ciblant l'ADN mitochondrial humain Mitochondries humaines ADN mitochondrial Mutations MitoCRISPR Cas12a Importation mitochondriale Human mitochondria Mitochondrial DNA Mutations MitoCRISPR Cas12a Targeting mitochondria 616.74 572.869 Maladies neuromusculaires Génétique ADN mitochondrial CRISPR (génétique) Les maladies neuromusculaires chez l’homme sont souvent causées par des mutations de l’ADNmt. La gravité de ces maladies dépend du niveau d’hétéroplasmie, où l’ADNmt mutant et sauvage coexistent dans la même cellule. Le développement d'approches expérimentales permettant la manipulation de l’ADNmt est crucial pour mettre au point des nouvelles thérapies. Ici, nous avons adapté le système CRISPR-AsCas12a de type V, qui reconnaît les séquences PAM riches en AT, pour une importation efficace dans les mitochondries humaines. La nucléase AsCas12a, portant le MTS de la sous-unité ATPase 9 de Neurospora crassa, exprimée dans une lignée cellulaire stable, a montré une localisation mitochondriale. Nous avons démontré que l’importation d’ARNcr ne nécessite pas de signaux de localisation mitochondriaux supplémentaires, mais dépend de sa structure secondaire. L’ARNcr peut être divisé en parties d’échafaudage et d’espacement, préservant ainsi la fonctionnalité du système, et l’espaceur peut être importé dans les mitochondries. Pour la première fois, en utilisant à la fois le séquençage Sanger et le séquençage de nouvelle génération, nous avons démontré qu'une délétion dans l'ADNmt humain peut être induite par un système CRISPR/Cas mitochondrial. Neuromuscular diseases in humans often stem from mutations in mtDNA. The severity of these diseases depends on the level of heteroplasmy, where both mutant and wild-type mtDNA coexist in the same cell. Developing methods to model mtDNA dysfunction is crucial for experimental therapies. Here, we adapted Type V CRISPRAsCas12a, which recognizes AT-rich PAM sequences, for efficient import into human mitochondria. The AsCas12a nuclease, bearing MTS from Neurospora crassa ATPase subunit 9, expressed in a stable cell line, showed mitochondrial localization. We demonstrated that crRNA import doesn't require additional mitochondrial localization signals, but depends on its secondary structure. We successfully split crRNA into scaffold and spacer parts, preserving functionality, with the spacer capable of being imported into mitochondria. For the first time, using both Sanger and next-generation sequencing, we demonstrated that a deletion in human mtDNA can be induced by a CRISPR/Cas system targeted to mitochondria. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 157430175 Université de Strasbourg Strasbourg 2024-12-31 https://theses.hal.science/tel-05443871 application/pdf 157512825 https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2023/NIKITCHINA_Natalia_2023_ED414.pdf http://www.theses.fr/2023STRAJ086/abes https://theses.hal.science/tel-05443871 https://theses.hal.science/tel-05443871 Nikitchina Natalia 1995-12-08 FR 275176215 0EFB1U065D5 21923708 4200047 https://theses.fr/2023STRAJ086 2023STRAJ086 https://doi.org/10.70675/c99eb17ez6dacz4932zbc3cz5f78ac1bc895 2023-10-26 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Strasbourg 131056549 Skolkovo Institute of Science and Technology (Moscou) MADS_ETABLISSEMENT_DE_COTUTELLE_1 251035581 Doctorat Docteur es non oui Entelis Nina MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 151894450 Duchêne Anne-Marie MADS_PRESIDENT_DU_JURY 131342509 Kunz Wolfram S. MADS_RAPPORTEUR_1 275176592 Mireau Hakim MADS_RAPPORTEUR_2 122997956 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 414 156502844 Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 156733447 93783 ddc:610 ddc:570 Skolkovo Institute of Science and Technology (Moscou) Entelis Nina Duchêne Anne-Marie Kunz Wolfram S. Mireau Hakim École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) PDF 157430175 confidentialité 2023-10-26 2025-12-31 confidentialité 2023-10-26 2025-12-31 restriction 2023-10-26 2025-12-31 confidentialité 2023-10-26 2025-12-31 confidentialité 2023-10-26 2025-12-31