Note ABES Pathogenic mutations of the mitochondrial protein ND5 : the development of novel gene therapy strategies Mutations pathogéniques de la protéine mitochondriale ND5 : développement de nouvelles stratégies de thérapie génique Mitochondries humaines Mutations de l'ADNmt MitoCRISPR AsCas12a Édition de l'ADNmt Human mitochondria MtDNA mutations MitoCRISPR AsCas12a MtDNA editing 572.8 572.6 ADN mitochondrial Mutation (biologie) Translocation (génétique) Les cellules humaines contiennent multiples copies d'ADNmt, qui code 37 gènes. L'ADNmt est sujet à des mutations qui peuvent conduire à des maladies affectant gravement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés. Nous nous sommes concentrés sur deux mutations pathogènes du gène MT-ND5, 13513G>A et 13514A>G, qui altèrent Asp393, un résidu essentiel à la translocation des protons lors de la synthèse de l'ATP. Notre objectif était d'évaluer si la technologie CRISPR/Cas12a peut être appliquée à l'ADNmt humain. Nous avons démontré que les crRNA chimiquement modifiés améliorent la spécificité de Cas12a à des concentrations physiologiques de Mg²⁺. L'activité spécifique des éditeurs de bases mitochondriales fusionnés à AsCas12a ciblant les gènes ND4 et ND5 de l'ADNmt a été démontrée à la fois in vitro et, pour la première fois, dans les mitochondries de cellules HEK293 en culture. Nous avons également démontré que Cas12a et crRNA fusionnés étaient importés dans des mitochondries isolées, montrant le potentiel de la technologie crosslink pour améliorer l'adressage mitochondriale de crRNA. Human cells contain multiple copies of mtDNA, which encodes 37 genes. mtDNA is prone to mutations that can lead to diseases severely affecting tissues with high energy demands. We focused on two pathogenic mutations in the MT-ND5 gene,13513G>A and 13514A>G, that alter Asp393, a residue critical for proton translocation during ATP synthesis. Our aim was to evaluate whether CRISPR/Cas12a technology can be applied to human mtDNA. We demonstrated that chemically modified crRNAs improve the specificity of the Cas12a system under physiological levels of Mg²⁺. The specific activity of AsCas12a-fused mitochondrial base editors targeting the ND4 and ND5 genes of mtDNA was shown both in vitro and, for the first time, in the mitochondria of cultured HEK293 cells. We also demonstrated that crosslinked Cas12a and crRNA were imported into isolated mitochondria, showing the potential of crosslink technology in enhancing crRNA mitochondrial delivery. Electronic Thesis or Dissertation Text en PDF 62511150 http://www.theses.fr/2024STRAJ095/document http://www.theses.fr/2024STRAJ095/abes Shebanov Nikita 1991-05-27 FR 273349937 213043494DB 22121627 4200047 https://theses.fr/2024STRAJ095 2024STRAJ095 https://doi.org/10.70675/1abd75e8za0bfz478fz97ffzb539dd99ee0c 2024-12-13 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Tarassov Ivan MADS_DIRECTEUR_DE_THESE_1 127895744 Friant Sylvie MADS_PRESIDENT_DU_JURY 139008217 Entelis Nina MADS_MEMBRE_DU_JURY_1 151894450 Kunz Wolfram S. MADS_RAPPORTEUR_1 275176592 Mireau Hakim MADS_RAPPORTEUR_2 122997956 École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) MADS_ECOLE_DOCTORALE_1 414 156502844 Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) MADS_PARTENAIRE_DE_RECHERCHE_1 156733447 93783 ddc:570 Tarassov Ivan Friant Sylvie Entelis Nina Kunz Wolfram S. Mireau Hakim École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) PDF 62511150 confidentialité 2024-12-13 2027-01-01 confidentialité 2024-12-13 2027-01-01 confidentialité 2024-12-13 2027-01-01 confidentialité 2024-12-13 2027-01-01