Micropuces à petites molécules : nouvel outil protéomique pour profiler l'activité enzymatique Protéomique Pas de mots clés en anglais 572.8 Protéomique Thèses et écrits académiques Nucléoprotéines Thèses et écrits académiques Acides nucléiques peptidiques Thèses et écrits académiques Filtres à protéines Thèses et écrits académiques Biopuces Thèses et écrits académiques Enzymes Thèses et écrits académiques Antienzymes Thèses et écrits académiques Les micropuces sont devenues incontournables pour la recherche post-génomique en permettant de cribler plusieurs milliers de composés dans quelques microlitres. Plusieurs stratégies ont été développées pour immobiliser sur ce format des petites molécules ou des anticorps pour la recherche de médicaments ou comme diagnostique. L'encodage de chimiothèque de petites molécules par des Peptid Nucleic Acid (PNA), possible par synthèse combinatoire (split and mix), permet d'organiser des micropuces par auto-assemblage des sondes sur ce support et de cribler ainsi l'activité enzymatique sans a priori à partir de mélange complexe tel que des lysats cellulaire. Nous avons développé la chimie peptidique et des PNA pour synthétiser et cribler 3 générations de chimiothèques d'inhibiteurs encodé par des PNA. Ces chimiothèques présentent 625 ou 4000 inhibiteurs basés sur le mécanisme d'action de protéases, étiqueté par une séquence unique de PNA encodant la structure d'un inhibiteur tetrapeptidiques ainsi que sa localisation spécifique sur une micropuce. De gros efforts portés sur l'optimisation du dépôt sur micropuce, la détection du signal et les conditions d'hybridation ont rendu cette stratégie suffisamment sensible et spécifique pour quantifier l'activité enzymatique et pour identifier des spécificités de substrats. Cette technique a été utilisée pour profiler l'activité enzymatique d'extrait allergisant d'acariens et pour détecter des spécificités de substrats d'enzymes purifiés. Les inhibiteurs identifiés sont assez spécifique pour distinguer l'activité d'enzymes proches d'une même famille et les enzymes cibles de ces inhibiteurs peuvent être identifiés par colonne d'affinité couplé à la spectrométrie de masse. De plus, les inhibiteurs identifiés permettent de bloquer l'activité d'un enzyme et d'évaluer sa relation avec un phénotype. Cette stratégie est actuellement la seule méthode fonctionnelle miniaturisée permettant de profiler l'activité enzymatique avec des inhibiteurs. Microarray has become an indispensable technology in postgenomic research area and allows for high throughput screening of several thousand analytes in few microliters. Several strategies have been developed to immobilize small molecules or antibodies on this format for drug discovery or for diagnostic tool. The peptide nucleic acid (PNA)-encoded small molecule library strategy allows for combinatorial libraries synthesize in a split and mix format to be organized into microarray by a self-sorting assembly. This methodology enables enzyme activity screening without a priori knowledge of the target in complex mixture such as crude cell lysates. Peptide and PNA chemistries were developed to synthesize and screen on a microarray format 3 generations of PNA-encoded inhibitor libraries targeting several protease families. Those libraries are presenting 625 to 4000 mechanism based inhibitors individually labelled with a PNA sequences that encodes the structure of a tetrapeptide inhibitor and its specific localisation onto a microarray. Substantial efforts on optimizing microarray spotting as well as signal detection and hybridization conditions presented in this thesis gives to PNA-encoded strategy a sensitive and specific format to quantify enzymatic activities and identify substrate specificities. The PNA-encoded strategy has been used to profiling enzyme activity from allergenic dustmite extract as well as to detect substrate specificities of purified enzyme samples. Identified inhibitors showed to be specific enough to decipher closely related activities of enzyme from the same family, and on the other hand, to identify the inhibitor s target enzyme by affinity column coupled to mass spectrometry. Finally, identified inhibitors can be used to knock down the activity of an enzyme and evaluate its correlation to a phenotype. This strategy is to date the only functional methodology that enable to profile enzyme activity with inhibitors in a miniaturized format. Electronic Thesis or Dissertation Text fr France PDF https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2007/DEBAENE_Francois_2007.pdf Université de Strasbourg Strasbourg Debaene François 1978-01-01T00:00:00 FR 159766435 http://www.theses.fr/2007STR13037 2007STR13037 2007-02-10T00:00:00 Chimie organique Université Louis Pasteur (Strasbourg) 026404540 Doctorat Docteur es non oui Winssinger Nicolas 115899383 École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....) ED222 156504081 ddc:570