XRCC1, un élément clef de la réparation des dommages de l'ADN couplée à la réplication XRCC1 PARP-1 ADN polyméraseα-primase DNA-PK réplication réparation de l'ADN Pas de mots clés en anglais 571.6 ADN Thèses et écrits académiques ADN Thèses et écrits académiques ADN Thèses et écrits académiques Toxicologie génétique Thèses et écrits académiques Cancer Thèses et écrits académiques XRCC1 est un facteur central des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR) ou des bases endommagées (BER). Il organise un réseau complexe d'interactions protéiques avec les acteurs de la réparation grâce à ses domaines BRCT1 et BRCT2. Le domaine BRCT1 interagit avec l'enzyme qui détecte et signale les cassures dans l'ADN, PARP-1, ainsi qu'avec le poly(ADP-ribose) (PAR), permettant son recrutement rapide au site de dommage. Afin de mieux comprendre les fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 dans la réparation des dommages de l'ADN, nous avons cherché à isoler de nouveaux partenaires par une approche protéomique s'appuyant sur la spectrométrie de masse. Nous avons identifié deux nouveaux partenaires : la sous unité catalytique de la protéine kinase DNA-PK impliquée dans la réparation de l'ADN par recombinaison non homologue (NHEJ) et la sous unité p58 du complexe ADN polymérase a-primase impliqué dans la replication de l'ADN. XRCC1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité in vitro de phosphorylation de la sérine 15 de p53. En retour, XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371 en réponse à une exposition aux rayonnements X et cette phosphorylation régule la transition entre une forme monomère et une forme dimère de XRCC1 et est requise pour la réparation efficace des casssures double brin in vitro. Le mutant non phosphorylable XRCC1-S371L'perd sa capacité à stimuler DNA-PK, et induit un défaut de réparation des cassures double brin induites par des rayonnements X. Nos résultats suggèrent que XRCC1 pourrait recruter DNA-PK pour engager la voie de réparation NHEJ lorsqu'une cassure simple-brin a été convertie en cassure double-brin lors de la phase S. XRCC1 interagit par son domaine BRCT1 avec la sous-unité p58 du complexe replicatif Pol a-primase et les deux protéines co-localisent in vivo. Nous montrons que p58 lie le PAR ce qui entraîne l'inhibition de l'activité primase. La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 dans des cellules HeLa induit l'hétéromodification du domaine BRCT1 surexprimé et l'accumulation des cellules en début de phase S après traitement par un agent alkylant. Nous montrons que ce blocage de la réplication à lieu entre la formation des complexes de pré-initiation et le recrutement de PCNA, et qu elle est dépendante de la synthèse de PAR Ce travail révèle une nouvelle fonction de XRCC1 et du PAR, qui est de réguler l'initiation de la réplication lorsque l'ADN est endommagé. L'ensemble de nos résultats décrivent XRCC1 et PARP-1 comme des éléments centraux de la coordination entre réparation et réplication de l'ADN, ainsi que dans la transition entre SSBR et DSBR. Lors de la réplication d'un ADN endommagé, le couple XRCC1/PARP-1, via le PAR porté par le domaine BRCT1 de XRCC1, frine l'avancement de la fourche de réplication en interagissant avec p58, inhibant de la sorte l'ADN primase. Ceci permettrait à la cellule de réparer les lésions présentes sur l'ADN afin d'éviter la collision entre la fourche de réplication et une cassure simple-brin de l'ADN non réparée. Néanmoins, en cas de conversion du SSB en DSB, XRCC1 stimule l'activité de DNA-PK afin de promouvoir la réparation du DSB. XRCC1 is a central player of single strand break (SSBR) and base excision (BER) pathways, organizing a complex protein interaction network with repair factors through its two BRCT domains. The BRCT1 domain interacts with both PARP-1, the enzyme that detects and signals DNA interruptions, and poly(ADP-ribose) (PAR), allowing its immediate recruitment to the DNA damaged sites. To get insights into the functions of the XRCC1 BRCT1 domain in the repair of DNA damages, we looked for new interactants by a mass specrometry based proteomic approach, and identified two new partners : the protein kinase DNA-PK involved in Non Homologous End Joining (NHEJ) repair pathway, and the p58 subunit of the replicative DNA polymerase a-primase complex. XRCC1 interacts with DNA-PK and stimulates its in vitro kinase activity on serine 15 of p53. In turn, XRCC1 is phosphorylated by DNA-PK on serine 371 in response to ionizing radiation. This phosphorylation controls the transition between a dimer and a monomer state of XRCC1 and is required for efficient DNA double-strand break repair (DSBR) as the non-phosphorylable mutant S371L was unable to stimulate DNA-PK and leads to unrepaired DSB induced by ionizing radiations. Our results suggest that XRCC1 could recruit DNA-PK to engage the NHEJ repair pathway when a SSB is converted to a DSB during S-phase. XRCC1 interacts through its BRCT1 domain with the p58 subunit of the DNA-Pol a-primase complex and the two proteins colocalize in vivo. The binding of PAR to p58 inhibits the activity of the DNA-primase. Overexpression of XRCC1 BRCT1 domain in HeLa cells induces BRCT1 domain heteromodification and accumulation of cells in early S-phase. We show that this replication arrest occurs between the assembly of pre-initiation complexes and the loading of PCNA to chromatin, and that it requires PAR synthesis. This work reveals a novel function for XRCC1 and PAR in the regulation of replication initiation when DNA is damaged. Altogether, our results reveal XRCC1 and PARP-1 as key components in the coordination between DNA replication and repair, and in the SSBR to DSBR transition. During replication of damaged DNA, XRCC1 and PARP-1, through the heteromodified XRCC1 BRCT1 domain, inhibits replication fork assembly and progression by interacting with p58, thus inhibiting DNA-primase activity. This would allow the cell to repair SSBs before they are converted to DSBs by collision with replication fork. Despite this process, if DSB are generated during replication of damaged DNA, XRCC1 can act as a molecular switch, stimulating DNA-PK to promote repair of DSBs by NHEJ. Electronic Thesis or Dissertation Text fr France PDF https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2007/LEVY_Nicolas_2007.pdf Université de Strasbourg Strasbourg Lévy Nicolas 1981-01-01T00:00:00 FR 137108079 http://www.theses.fr/2007STR13183 2007STR13183 2007-11-22T00:00:00 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Université Louis Pasteur (Strasbourg) 026404540 Doctorat Docteur es non oui Murcia Gilbert de 074791699 Menissier de Murcia Josiane 031370411 École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) ED414 156502844 ddc:570