Isolement de protéines cellulaires interagissant avec une région particulière du génome du virus de l'hépatite C : étude de l'implication de ces interactants sur le cycle viral
Langue Français
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Auteur : Benga, Wagané Joseph Antoine
Date de soutenance : 27-11-2008
Directeur(s) de thèse : Schuster, Catherine
Établissement de soutenance : Université Louis Pasteur (Strasbourg)
École doctorale : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie, Médecine et santé
Mots-clés libres : apolipoprotéine E , SLEI , virus de l'hépatite C , production de particules infectieuses
Mots-clés :
- Virus
- Thèses et écrits académiques
- Protéines virales
- Thèses et écrits académiques
- Apolipoprotéine E
- Thèses et écrits académiques
- Médicaments
- Thèses et écrits académiques
Résumé : La formation du complexe de réplication du virus de l'hépatite C est une étape-clé dans le cycle viral. Nous avons précédemment montré que les 220 derniers nucléotides de l'extrémité 3 du brin (-) se replient en cinq tiges-boucles stables formant le domaine I (Schuster et al. 2002, J. Virol, 76:8058-68). La comparaison des sites d'initiation de la réplication des brins moins (-) et plus (+) a révélé des caractéristiques communes notamment une forte homologie entre la tige-boucle SLEI du brin ( ) et la tige-boucle SLII du brin (+). Dans le but d'investiguer la fonction de la tige-boucle SLEI dans le cycle viral et les interactions hôte-virus, nous avons criblé des protéines cellulaires interagissant avec SLEI par la méthode du triple-hybride dans la levure, SLEI servant d'appât et une banque d'ADNc de foie humain de proie. Un mutant de la séquence homologue a servi de contrôle négatif pour confirmer la spécificité de l'interaction. Ce criblage a identifié une forme tronquée de l'Apolipoprotéine E (ApoE) comme une protéine hépatocytaire interagissant avec la tige-boucle SLEI du brin (-) Pour évaluer la pertinence fonctionnelle de cette interaction, nous avons bloqué l'expression de l'ApoE par de petits ARN interférents spécifiques (siARN) dans des cellules Huh7.5 transfectées avec l'ARN génomique complet de la souche Jc1 du VHC. L'extinction de l'expression de l'ApoE a entrainé une forte inhibition de la production de particules infectieuses sans affecter le niveau de réplication du virus. Ces résultats indiquent que SLEI pourrait recruter ApoE au niveau du complexe de réplication et que ce recrutement est important pour l'accomplissement du cycle viral aboutissant à la production de particules infectieuses. Pour mieux comprendre le mécanisme d'intervention de l'ApoE, nous avons recherché une interaction entre les protéines virales et ApoE par la méthode du double-hybride dans la levure. Seule, la protéine non structurale NS5A du VHC interagit avec ApoE dans ce système d'étude. Cette interaction a été confirmée par des analyses d'immunoprécipitation dans des cellules Huh7.5 répliquant Jc1. Pour discriminer si ApoE intervient spécifiquement dans la sécrétion des virions ou plus précocement dans leur assemblage, nous avons évalué l'infectivité de particules virales récoltées à partir de surnageants de culture ou des lysats de cellules Huh7.5 répliquant Jc1 dans lesquelles l'expression de l'ApoE a été bloquée par des siARN spécifiques. Les particules virales récoltées ont été purifiées et concentrées au moyen de gradients d'iodixanol puis utilisées pour infecter des cellules Huh7.5 naïves. Les particules virales provenant des lysats cellulaires sont plus infectieuses que celles issues de surnageants de culture cellulaire. Nos résultats démontrent une forte implication de l'ApoE dans la sécrétion des virions du VHC et en font une cible intéressante pour la thérapie antivirale.
Entrepôt d'origine : 
Identifiant : ecrin-ori-298729
Type de ressource : Thèse
