Ingénierie d'une protéase monospécifique pour le diagnostic du glucose sanguin
Langue Anglais
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Auteur : Ciréfice, Morgane
Date de soutenance : 21-09-2009
Directeur(s) de thèse : Weiss, Etienne
Établissement de soutenance : Université de Strasbourg
École doctorale : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
Discipline : Sciences de la vie et de la santé
Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie, Médecine et santé
Mots-clés libres : Glucose sanguin
Mots-clés :
- Glucose sanguin
- Thèses et écrits académiques
- Peptidases
- Thèses et écrits académiques
- Sérine-protéases
- Thèses et écrits académiques
- Diabète
- Thèses et écrits académiques
Résumé : Le dosage sanguin de la glycémie via le taux d'hémoglobine glyquée (HbA1c) est un paramètre-clé de la surveillance du diabète à long terme. Roche Diagnostics GmbH s'est engagé avec la Fédération Internationale de Chimie Clinique et de Médecine de Laboratoire (IFCC) à développer un système standard de référence international de contrôle de la glycémie. L'endopeptidase glutamique (GluC) de la souche V8 de Staphylococus aureus (EC 3.4.21.19) est utilisée pour la digestion de l'HbA1c. L'objectif de cette thèse de doctorat est d'augmenter la vitesse d'hydrolyse de la GluC par évolution moléculaire tout en préservant ses caractéristiques enzymatiques originelles (spécificité et stabilité) dans les conditions standardisées du test fonctionnel de l'HbA1c. La construction de librairies de plusieurs milliers de variants, couplée à un criblage multiparamètre, a permis d'isoler un mutant de la GluC qui comporte les propriétés recherchées. Ce variant a été exprimé chez B. subtilis par sécrétion extracellulaire et purifié par chromatographie d'affinité Ni-NTA. Il a été ensuite caractérisé après activation par autoprotéolyse. Le variant présente une activité spécifique 3 fois supérieure et une constante d'affinité (Km) trois fois meilleure à celle de la GluC sauvage pour le substrat synthétique: Z-Phe-Leu-Glu-pNa dans un tampon de Tris-HCl à pH 7.8. Le variant est 4 fois plus actif dans un tampon d'acétate d'ammonium à pH 4.3 avec l'hexapeptide de l'hémoglobine pour substrat. Il est également plus stable à 50°C. Bien que plus actif que la GluC sauvage en présence de substrats synthétiques, le variant isolé est moins performant d'un point de vue activité, affinité et spécificité de coupure pour l'hexapeptide de l'hémoglobine entière.
Entrepôt d'origine : 
Identifiant : ecrin-ori-298739
Type de ressource : Thèse
