Two-color fluorescent dyes for sensing peptide interactions : application to the retroviral proteins Sondes fluorescentes à émission duale pour la caractérisation d'interactions impliquant des protéines : application aux protéines rétrovirales Sondes fluorescentes Pas de mots clés en anglais 572.8 570.28 572.6 Sondes fluorescentes Thèses et écrits académiques Réactions de transfert de protons Thèses et écrits académiques VIH (virus) Thèses et écrits académiques Dans ce travail, nous avons développé des sondes sensibles à l'environnement pour suivre les interactions de protéines entre elles, avec des acides nucléiques ou avec des membranes. Dans ce but, nous avons développés des fluorophores de la famille des 3-hydroxychromones (3HC) et des 3-hydroxyquinolones (3HQ). Ces sondes présentent à l'état excité une réaction de transfert de proton intramoléculaire (ESIPT) conduisant à deux bandes d'émission, permettant de caractériser les propriétés de cet environnement via le rapport d'intensités de ces deux bandes. La réaction ESIPT des 3HQs s'est révélée être irréversible et sensible à la polarité, à la basicité et la viscosité du milieu, contrairement aux 3HCs qui ne sont pas sensibles à cette basicité et donnent une réponse claire aux modifications de polarité et d'hydratation. Deux sondes ont été couplées au groupement amino-terminal de peptides préparés par synthèse en phase solide. En marquant la protéine de la nucléocapside (NC) de HIV-1 par la 2-furyl-3 hydroxychromone, une forte baisse, corrélée à la structure du complexe obtenu, du rapport d'intensité des deux bandes est observée lorsque NC se fixe à des oligonucléotides. Cette réponse peut être utilisée pour identifier le site de fixation préférentiel de NC. Cette sonde a également été appliquée avec succès pour suivre l'interaction d'un petit peptide avec son anticorps. Le marquage du domaine C-terminal de la protéine Vpr de HIV-1 avec la 4 -dimethylamino-3 hydroxyflavone sensible aux milieux apolaires a été utilisé pour déterminer la localisation du peptide lié à une biomembrane et préciser l'affinité du peptide en fonction de la phase et de la composition de la membrane. The task of the present work was to develop environment sensitive labels for monitoring protein interactions with nucleic acids, membranes and other proteins. Fluorophores of the 3 hydroxychromone (3HC) and 3 hydroxyquinolone (3HQ) family have been considered. They undergo an excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) reaction leading to two emission bands thus allowing to characterize the environment properties through their intensities ratio. 3HQs were shown to undergo an irreversible ESIPT reaction and to be sensitive to the polarity, the H-bond basicity and the viscosity of the media. In contrast, the spectroscopic response of 3HCs is not sensitive to basicity and shows a clear response on polarity and hydration changes. Two different labels were proposed for sensing protein-DNA and protein-membrane interactions. Since DNA and membrane environment strongly differ by their polarity. The labels were coupled to the N terminal amino group of peptides prepared by solid phase synthesis. The probe based on 2-furyl-3 hydroxychromone was used for labeling HIV-1 nucleocapsid protein (NC) and shows a several-fold sequence-dependent decrease of the emission band ratio on NC-binding to oligonucleotides. This property was then used to identify the NC preferential binding site on oligonucleotides. The label was also successfully applied for sensing the interaction of a short peptide with an antibody. Labeling of the C-terminal domain of the HIV-1 Vpr protein with the 4 -dimethylamino-3 hydroxyflavone derivative was used to determine the location of the peptide in the membrane and the relationship between the affinity of the peptide and the membrane composition and phase. Electronic Thesis or Dissertation Text en France PDF https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2009/SHVADCHAK_Volodymyr_2009.pdf Université de Strasbourg Strasbourg Shvadchak Volodymyr 1983-01-01T00:00:00 FR 086491865 http://www.theses.fr/2009STRA6025 2009STRA6025 2009-04-20T00:00:00 Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Université de Strasbourg 131056549 Doctorat Docteur es non oui Mély Yves 074722174 Rocquigny Hugues de 129525073 École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) ED414 156502844 ddc:570