Fonction et structure du complexe entre l'intégrase du VIH-1 et deux protéines cellulaires (LEDGF et INI1)
Langue Français
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Auteur : Maillot, Benoit
Date de soutenance : 09-09-2010
Directeur(s) de thèse : Ruff, Marc
Établissement de soutenance : Université de Strasbourg
École doctorale : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie
Mots-clés libres : HIV-1 integrase , LEDGF , INII/SNF5 , structure
Mots-clés :
- Intégrase du VIH
- Thèses et écrits académiques
- Interactions ADN-protéine
- Thèses et écrits académiques
- VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1)
- Thèses et écrits académiques
Résumé : Le génome viral inversement transcrit du VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine type 1 est intégré dans le génome de la cellule cible par l'intégrase, une protéine virale de 288 acides aminés. L'intégrase est partie intégrante d'un important complexe nucléoprotéique, le complexe de pré-intégration (CPI). Ce complexe est formé après la reverse transcription dans le cytoplasme de la cellule infectée. Il migre par l'intermédiaire des microtubules jusqu à l'enveloppe nucléaire où il est transporté dans le noyau à travers le pore nucléaire. Le CPI est composé d'ADN et de protéines virales dont l'intégrase. D autres protéines virales (VPR, NC, CA) et des protéines cellulaires participent à ce complexe. Parmi les protéines cellulaires identifiées s'illustrent notamment LEDGF (Lens Epithelium-Derived Growth Factor) et INI1 (INtegrase Interactor 1). Cette protéine aussi appelée SNF5 est une composante du complexe SWI-SNF de remodelage de la chromatine. Mon travail de thèse s'articule autour de la résolution de structures tridimensionnelles de l'intégrase du VIH-1 en complexe avec LEDGF et INI1. Mon sujet consistait à réaliser une stratégie permettant d'aboutir à la formation in vitro de ce complexe. Par une analyse bioinformatique de la protéine INI1, j ai défini les limites de différents domaines potentiellement stables d'INI1 contenant le domaine de liaison à l'intégrase (IBD). Après clonage et expression dans le système bactérien E.coli. J ai mis au point la production à grande échelle et la purification des fragments ayant la meilleure solubilité. Après avoir obtenu un complexe stable, J ai résolu la structure du complexe ternaire entre l'intégrase pleine longueur type sauvage, LEDGF et l'IBD d'INI1 par microscopie électronique. Les structures cristallographiques connues des domaines de l'intégrase ont été positionnées dans la carte de densité électronique. J ai mis au point des tests fonctionnels originaux basées sur les techniques d'anisotropie de fluorescence qui m ont permis de tester l'affinité du complexe pour l'ADN ainsi que l'activité enzymatique de 3 processing. Les résultats indiquent qu au sein du complexe ternaire, l'IBD de INI1 réduit significativement l'affinité pour l'ADN cible et dans une moindre mesure l'affinité pour l'ADN viral. De plus, l'IBD d'INI1 inhibe totalement la réaction de 3 processing. La structure du complexe ternaire nous permet de visualiser les postions relatives des différentes protéines dans le complexe. On montre que le complexe est formé de 4 molécules d'intégrase, deux molécules de LEDGF et deux molécules d'INI1. La combinaison de ces résultats avec les tests fonctionnels nous permettent de proposer un modèle et un rôle pour INI1 qui serait d'empêcher l'auto intégration de l'ADN viral sur lui-même quand le CPI se trouve dans le noyau cellulaire.
Entrepôt d'origine : 
Identifiant : ecrin-ori-308937
Type de ressource : Thèse
